مقرر مادة ميكرو بيولجيا المياه والصرف الصحي

[

مقرر ميكروبيولوجيا المياه والصرف الصحى

]
[الدروس العملية]

Dr.Taha Abdel-Fattah khodair

[1431

مقدمــة
نظراً لأن الماء يعتبر عاملاً هاما في حياه الإنسان لذلك يجب حمايته والمحافظــة عليه من التلوث. ومن مظاهر تلوث مصادر المياه وجود تيفود وبائي أو ظهور سمك ميت علي شواطي البحيرة ، ويحدث هذا التلوث نتيجة لإلقاء المخلفات في المياه مما يسبب تغيرات جوهرية وضارة في أنواع وأعداد ونشاط الميكروبات الموجود بالوسط المائي .
ولكي نتمكن من مراقبة الاستخدام السليم للمياه يجب ان تكون لدينا طرق ووسائل للكشف علي التلوث وقياسه.
التحليل القياسي للمياه
للكشف عن صلاحية المياه للشرب لابد من إجراء مجموعة من التحاليل المعملية حتي يمكن الحكم علي مدي صلاحية هذه المياه للشرب وهذه التحاليل تتمثل في.
اولاً : الفحص البكتريولوجي :-
والهدف الأساسي من هذه التحاليل هو معرفة ما إذا كانت مصادر المياه تحتوي علي ميكروبات برازيــة ( وليست بالضرورة أن تكون مرضيــة ) حيث يؤخذ وجود هذه الميكروبات البرازيــة كدليل علي تلوث المياه بالمخلفات الآدميــه أو الحيوانية وبصفة عامة فإن الميكروبات التي يبحث عنها هي بكتريا القولون و هي المجموعة التي تشمل كل الميكروبات الهوائية والاختيارية والتي تتميز بأنها عصويات قصيرة مستقيمة سالبة جرام – غير متحركة – تخمر سكر اللاكتوز مع أنتاج غاز.

ثانياً: الفحص أو التحليل الكيمائي :-
وفي هذا النوع من التحليلات يتم قياس العناصر والاينونات التي يدل وجودها بتركيز عالي علي تلوث المياه مما يؤدي للإضرار بصحة الإنسان والحيوان والنبات.
حيث يتم قياس :-
1- تقدير الأملاح الكلية الذائبـة بطريقة التوصيل الكهربى E.C
2- تقدير رقم الحموضة .
3- تقدير انيونات الكربونات و البيكربونات و الكلوريدات.
4- تقدير الكبريتات.
5- تقدير المادة العضوية والنيتروجين.
بالاضافة إلي قياس بعض العناصر الضارة عند وجودها بتركيز عالي في عينة المياه مثل عنصر البورون – الموليبيدنم – الرصاص .. الخ
من خلال مجموعة التحليلات السابقة يمكن الوقوف علي مدي صلاحية المياه للشرب وذلك من خلال الجداول القياسية الخاصة بنسب هذه العناصر في المياه.
اولأ: الفحص البكتريولوجي للمياه.
الطرق المتبعـة لتقدير اعداد البكتريا في الماء لا يعطي الإ جزء من العدد الفعلي للكائنات لأن معظم الميكروبات لا تنمو علي البيئة المستخدمــة ولايهمنا العدد الكلي بدرجة كبيرة مثل ما يهمنا بوجه خاص تواجد مجموعة بكتريا القولون التي قد تصل إلي المياه عن طريق التلوث بمياه المجاري ولذلك فإنة لاختبار صلاحية عينه المياه لاغراض الشرب والاستخدام المنزلي وللاستخدام في المصانع يجري عليها الآتي:.
العد الكلي للميكروبات في عينة المياه........... اختبار تلوث العينة بمياه المجاري
* طريقة اخذ العينات للتحليل
الشروط الواجب أخذها في الاعتبار عند أخذ عينة مياه للتحليل.
1- يجب أن تمثل العينة مصدر المياه المطلوب فحصه.
2- يجب أخذ الاحتياطات اللازمــة لعدم تلوث العينة أثناء أخذها.
3- عند أخذ العينة من ماء الحنفية يلاحظ تعقيم فوهـة الحنفية باستخدام اللهب مع ترك الحنفية مفتوحـة قبل اخذ العينة لمدة 5 دقائق.
4- عند اخذ العينة من ترعة أو نهر أو أي مصدر مياه أخر فإنه يجب أن تؤخذ من تحت سطح الماء وذلك بفتح غطاء الزجاجة المعقمــة تحت سطح الماء.
5 - إذا كانت من مياه الطلمبات تترك الطلمبــة تعمل فترة من الزمن تكفي للتخلص من المياه المخزنــة بالمواسير وذلك قبل أخذا العينة.
6- إذا كانت من مياه معاملة بالكلور يوضع في زجاجة جمع العينات 0.02 جم مسحوق ثيو سلفات الصوديوم لكل لتر ، حيث تتحد هذه المادة مع الكلور المتبقي بالمياه فتوقف تأثيره.
7- يجب أن تجري الأختبارات البكتريولوجية مباشرة بعد أخذ العينة وإذا وجد أن الزمن سوف يزيد عن 3 ساعات تحفظ العينات في ثلاجــة من 5 إلي 10 درجة مئوية لمنع حدوث أي تغير بالعينــة.
*العد الكلي للبكتيريا بالماء كدليل علي صلاحيته للشرب
تعتبر المقياس الامريكية أن الماء صالحا للشرب إذا أحتوي علي عدد كلي من البكتريا أقل من 100 ميكروب ملي مقدرة بطريقة الاطباق علي بيئة الاجار ، المحضن علي درجة 37 م لمدة 24 ساعة ويختلف العدد الناتج بطبيعة الحال باختلاف طريقة اخذ العينة وطريقة التقدير ونوع البيئة ودرجة حرارة التحضين وبالنسبة للمياه المعدنية فيجب أن لا يزيد عدد البكتريا الكلي عن 20 ميكروب \مل وفي المواصفات الأمريكية ، فان الماء الصالح للشرب ، يجب أن يحتوي علي أقل من 2 بكتريا كولاي لكل 100 مل ماء ، فإذا زاد العدد عن 100 كولاي لكل 100 مل فإن الماء لايعتبر صالحا للشرب.
- الأدوات والمواد المستخدمــة :-
- زجاجة عينة مياه معقمــة .
- بيئة آجار التربتون والجلوكوز ومستخلص الخميرة .
- اطباق بتري وماصات معقمــة .
- انابيب مياه مقطره معقمــة بكل انبوبة 9 مل ماء .
طريقة العمل :-
1- رج عينة المياه جيداً حوالي 25 مره
2- انقل بواسطـة ماصة معقــمــة مقدار1مل من عينة الماء إلي انبوبة بها 9 مل ماء معقم فيصبح التخفيف 10-1
3- استمر في عمل سلسلة التخفيفات مع ملاحظــة كتابة ارقام التخفيفات علي الأنابيب مع استعمال ماصـه
واحدة لكل تخفيف بشرط أن تكون معقمــة.
4- ينقل من انابيب التخفيف 1مل إلي أطباق بتري مع ترقيم الاطباق بما يتناسب مع كل تخفيف حيث يتم عمل طبقين من كل تخفيف مع ملاحظــة استخدام ماصات معقمـــة لكل تخفيف علي حده أو استعمال ماصة واحدة معقمة على ان يكون النقل من التخفيف الاعلي إلي الاقل.
5- يلي ذلك صب بيئة آجار التربتون والجلوكوز ومستخلص الخميرة علي الاطباق وذلك بعد إسالة البيئة و تبريدها الى50 – 55 °م ثم تحضن الاطباق مقلوبة علي 37°م لمدة 48 ساعة.
6- بعد انتهاء مدة التحضين يتم عد مجاميع الميكروبات علي الأطباق وتسجيل النتائج حيث تستبعد الأطباق التي
بها أقل من 30 أواكثر من 300 مستعمرة.
7- خذ المتوسط الحسابي من كل طبقين من تخفيف واحد ثم أضرب في مقلوب التخفيف فينتج عدد البكتريا
في 1 مل من العينة.

*.اعداد الميكروبات الكلية في 1 مل عينة مياة (C.F.U)= متوسط اعداد الميكروبات في التخفيف χ مقلوب التخفيف
C.F.U = Colony Forming Unite
*العد الكلي للفطريات بالماء كدليل علي صلاحيته للشرب
نفس الخطوات السابقة ولكن مع تغير البيئة تالغذائية المستخدمة الى بيئة مستخلص المولت
*الكشف عن البكتريا المتجرثمة اللاهوائية
ويتم ذلك بتلقيح بيئة اجار الجلوكوز والتربيتون والحديدوز الصلبة بطريقة الوخز من عينة المياة وتحضين تحت الظروف اللاهوائية وبعد التحضين يظهر الميكروب اللاهوائى فى قاع الانبوبة ولون اسود اما اذا استخدم بيئة لا تحتوى على املاح الحديد يظهر نمو فى قاع الانبوبة فقط
*الكشف عن مجموعة القولون Coliform group
يهدف هذا التحليل الى الكشف عن وجود بكتريا القولون فى المياه حيث أن وجودها فى أى مصدر مائى يدل على تلوث هذا المصدر بمياه الصرف الصحى ويتكون هذا التحليل من ثلاثه مراحل اساسيه وهى :ـ
1) الاختبار الاحتمالى Presumptive test
2) الاختبار التأكيدى )التحقيقى) Confirmatory test
3) الاختبار التكميلى Completed test
ويتم فى المرحله الآولى الكشف عن الميكروبات القادره على تخمير سكر اللاكتوز مع انتاج غاز وهذه احدى الصفات المميزه لبكتريا القولون .
أما فى المرحله الثانيه يؤخذ عينه من الانابيب الموجبه (أى أعطت نمو وكونت غاز فى بيئه مرن اللاكتوز ، ويلقح هذه العينه فى بيئه انتقائيه Selective تفرق بين ميكروبات القولون
اما فى المرحله الاخيره (الاختبار التكميلى) فتعزل الميكروبات التى اعطت تفاعلات نموذجيه وتنمى فى مزارع نقيه والتى يجب أن تبين الشكل المورفولوجى والخواص الفسيولوجيه المميزه لبكتريا القولون وفيما يلى الشرح التفصيلى لهذا التحليل . ويمكن إجراء هذا الاختبار على عينه من مياه من المنزل أو نهر أوبحيره أو أى مصدر مائى يشبه فى تلونه بمياه الصرف الصحى .
أ ) الاختبار الاحتمالى Presumptive test
1ـ لقح 1 مل من عينه الماء فى عدة أنابيب بكل منها 10مل بيئة ماكونكى السائلة المحتوية على انبوبة درهام
2ـ حضن الانابيب على درجه 37ºم /2يوم
3ـ افحص بعد 24 ساعه وبعد 48 ساعه واكشف عن وجود غاز فى اى انبوبة بعد 24 ساعه يعنى اختبارا احتماليا موجبا
أما تكون الغاز خلال فتره ال24 ساعه التاليه ، فيعتبر إختبارا مشكوكا فيه أماعدم تكون غاز بعد 48 ساعه من التحضين ، يعنى اختبارا سالبا ، مما يدل على أن عينه الماء لاتحتوى على بكتريا القولون
ب ) الاختبار التأكيدى )التحقيقى) Confirmatory test
يجرى هذا الاختبار لكل العينات التى أعطت فى الاختبار الاحتمالى اختبارات موجبه او مشكوكا فيها .
1 ـ من انبوبه ماكونكى الموجبه للاختبار الاحتمالى ، خطط طبق بيئه أجار الأيوسين وأزرق الميثلين أوطبق أجار اندو بطريقه مناسبه لتكوين مستعمرات متباعدة تماما.
2 ـ حضر على درجه37ºم لمده يومين
إذا تكونت مستعمرات نموذجيه على سطح الطبق خلال فتره التحضير ، فإن الاختبار التأكيدى يعتبر موجبا
ج ) الاختبار التكميلى
1 ـ من بيئه أجار الأيوسين وأزرق الميثيلين أو من بيئه أجار إندو ، اختبر مستعمرتين يظهر من شكلهما أنهما من المحتمل جدا أن تكونا لميكروبات مجموعه بكتريا القولون ، وانقل كل منهما على سطح أجار مائل ، وإلى أنبوبه بيئه مرق تخمر اللاكتوز .
(بكتريا القولون ، على بيئة EMB وبيئة أجار إندو ، تعطى مستعمرات غامقه غالبا – وليس دائما – وتكون سوداء ذات بريق معدنى فحضر على بيئة EBM ، حمراء ذات بريق معدنى أخضر ذهبى على بيئه أجار إندو .
2ـ حضن على درجه37 ºم لمدة يومين 0
3ـ حضر شرائح من الأجار المائل ، واصبغ بصبغة جرام وبصبغه الجراثيم تكون الغاز فى مرق اللاكتوز ووجود بكتريا عصويه سالبه لجرام غير متجرثمه بمزارع الأجار ، يعتبر اختبارا تكميليا مرضيا ، يدل على وجود أفراد مجموعة بكتيريا القولون ، وعلى أن عينه الماء الأصليه ملوثه 0
التفرقة بين أفراد مجموعه القولون
DIFFERENTIATION OF MEMBERS OF THE COLIFORM GROUP
تشمل مجموعه القولون على ثلاث تحت مجاميع Subgroups هـــى :
1- E.coli.
2- E.freundii (Intermediate)
3- Enterobacter aerogenes
ونظرا لأن المصدر الاساسى ل E.coli هو القولون (البراز) لذا فان وجود E.coli فى العينه فهو دليل على تلوثها من فضلات انسان أو حيوان ونظرا لتشابه افراد مجموعه القولون فى الصفات الظاهريه فبالتالى لابد من وجود طرق يمكن ان تتبع فى التفرقه بين افراد هذه المجموعه . ومن هذه الاختبارات الآتى :
1- اختبار الاندول : Indole production
ويعتمد على قدرة بعض الميكروبات على تحليل الحامض الامينى تربتوفان Tryptophane وانتاج الاندول . ويلاحظ ان E.coli قادره على انتاج الاندول بعاتقي الله En. aerogenes
الادوات اللازمه :
1- مزرعه E.coli عمرها 24 ساعه فى المرق المغذى .
2- مزرعه En. aerogenes عمرها 24 ساعه فى المرق المغذى .
3- انابيب تحتوى على مرق التربتون Tryptone broth .
4- ورق حامض الااتقي اللهاليك Genezda oxalic acid test paper
5-
طريقة العمــــــل :
1 – لقح انبوبه بيون التربتون بميكروب E. coli واخرى بميكروب En. aerogenes
2 – ثبت فى كل انبوبه ورقه حامض ااتقي اللهاليك بواسطه السدادة القطنية بحيث يكون جزءا منها معلقا داخل الانبوبه .
3 – حضن الانابيب على 37ºم لمدة يومين .
4 - بعد انتهاء فترة الحضين اختبر للاندول وذلك بتلون ورقه حامض الااتقي اللهاليك باللون الاحمر.

2- اختبار احمر الميثيل Methyl red test

وهذا الاختبار يعتمد على قدرة E. coli على تكوين كميه من الحامض فى البيئه أكثر من تلك التى ينتجها En. aerogenes وبالتالى يمكن ل E. coli تغيير لون الدليل الى الاحمر
ينما يظل لونه الاصفر مع En. aerogenes .
الأدوات والمواد اللآزمة :
1- مزرعه E. coli عمرها 24 ساعة فى المرق المغذى .
2- مزرعه En. aerogenes عمرها 24 ساعه فى المرق المغذى .
3- 3 انابيب بويون الجلوكوز .
4- دليل احمر الميثيل Methyl red .
طريقه العمــــل :
1 – لقح انبوبه من بيون الجلوكوز بميكروب E. coli والانبوبة الاخرى بميكروب En. aerogenes واترك الثالثة للمقارنه (بدون نلقيح) .
2 – حضن على 37ºم لمدة 2-5أيام .
3 – أضف خمس نقط من دليل احمر الميثيل الى كل انبوبة ثم امزج جيدا .
يلاحظ أنه اذا تكون لون احمر فهذا دليل ان الاختبار موجبا بينما اللون الاصفر يدل على انه سالبا .
3 – اختبار فوجز – بروسكور (Vogus- proskauer test) V.P.
هذا الاختبار على قدرة ميكروب En. aerogenes على تكوين مركب الاسيتيل ميثيل كاربينول (A.M.C) فى عملية التحويل الغذائى فى حيث أن E. coli لاينتج هــذا المركب فى البيئه .
وتعتمد طريقة الكشف عن وجود ال Acetyl methyl carbinol على ان هذا المركب فى وجود البوتاسا او الصودا الكاوية فى ظروف تهويه جيدة (الهواء الجوى) فانه يتأاتقي اللهد الى ثنائى الاسيتيل Diacetyl الذى يعطى مع الالفا نافثول Alpha Naphthol وكذا الحامض الامينى الارجينين Arginine الموجود بالببتون لونا احمر ، وفى حالة عدم وجود الالفا نافثول فيمكن استخدام الكرباتين Creatine بكميه صغيرة جدا0 النتائج تقرأ بعد 2 – 4 ساعات من المعاملات .
الأدوات والمواد اللازمه :
1- مزرعة E.coli عمرها 24 ساعة فى المرق المغذى .
2- مزرعة En. Aerogenes عمرها 24 ساعة فى المرق المغذى .
3- 3 انابيب مرق الجلوكوز والفوسفات والببتون .
4- محلول NAOH أو KOH 40% .
5- محلول الالفا نافثول أومسحوق الكرباتين .
خطوات العمـــل :
1-لقح انبوبة من جلوكوز الفوسفات والببتون من مزرعة En. aerogenes والاخرى من مزرعة E. coli والثالثة تترك للمقارنة .
2-حضن على 37 ºم لمدة 48 ساعة .
3-بعد فترة التحضين أضف مقدار 1 مل من NAOH وبضع من الالفانافثول (أو قليل من الكرياتين) ثم أمرج جيدا واترك الانابيب فترة من 2-4 ساعات ثم دون النتيجة .
يلاحظ تكون لون احمر على السطح فى حالة ما اذا كان الاختبار موجبا .
4-اختبار تمثيل السترات :Citrate utilization test (Koser,s test)
ويعتمد الاختبار على قدرة En. Aerogenes وبعض ال Intermediates على تمثيل السترات كمصدر وحيد للكربون فى بيئة مكونه من املاح معدنيه فى حين ان E.coli لايمكنه ذلك .
الادوات والمواد اللازمة :
1- مزرعة من E.coli عمرها 24 ساعة فى المرق المغذى .
2- مزرعة من En. Aerogenes عمرها 24 ساعه فى المرق المغذى .
3- 3 انابيب تحتوى على بيئه سترات .

طريقــة العمــــل :
1- لقح انبوبة من بيئه السترات من مزرعه E.coli وأخرى من مزرعه En.aerogenes وتترك الثالثه للمقارنه .
2- حضن على 37ºم لمدة اربعه ايام .
3- بعد فترة التحضين شاهد النمو من عدمه فى الانابيب حيث ان وجود النمو يكون دليلا على ان الاختبار موجبا .

تقدير عدد ميكروبات القولون بطريقة MPN
- الأدوات والمواد المستخدمــة :-
- زجاجة عينة المياه.
- بيئة مكونكى السائلة فى انابيب .
- ماصات معقمــة .
- انابيب مياه مقطره معقمــة بكل انبوبة 9 مل ماء .
طريقة العمل :-
1- رج عينة المياه جيداً حوالي 25 مره
2- انقل بواسطـة ماصة معقــمــة مقدار1مل من عينة الماء إلي انبوبة بها 9 مل ماء معقم فيصبح التخفيف 10-1
3- استمر في عمل سلسلة التخفيفات مع ملاحظــة كتابة ارقام التخفيفات علي الأنابيب مع استعمال ماصـه
واحدة لكل تخفيف بشرط أن تكون معقمــة.
4- ينقل من انابيب التخفيف 1مل إلي انابيب ماكونكى السائلة (3 انابيب او 5 انابيب) مع ترقيم الانابيب بما يتناسب مع كل تخفيف.
5- يلي ذلك تحضين النابيب علي 37°م لمدة 48 ساعة.
6- بعد انتهاء مدة التحضين يتم عد الانابيب الموجبة (التى ظهر بها نمو) فى كل تخفيف.
7- عندما يعطى احد التخفيفات نتيجة سالبة (الخمس او الثلاث انابيب ليس بها نمو) ناخذ نتائج الثلاث تخفيفات السابقة لها وترقم P1:P2:P3 ويتم الكشف عن هذة الارقام فى الجداول المتخصصة لها.

*.اعداد الميكروبات الكلية في 1 مل عينة مياة = رقم x MPN مقلوب التخفيف الاوسط P2

Aspergillus sp.

Rhizopus sp.

Penicillium sp.

Bacillus sp.

Micrococcus sp.

Pseudomonas sp.

E.coli

موضوع مهم
شكرا لك
من فضلك ما مصدر هذه المعلومات
الكتاب عنوانه و صاحبه
و اذا كان مترجم فارجو منك وضع الرابط

» شرائح مقرر الفطريات (الرجاء التسجيل لكي تظهر الصور)
» شرائح مادة الطحالب ( الرجاء التسجيل كي تظهر الصور)